PERCOBAAN I
Isolasi, Identifikasi Dan Pemurnian
Kofein Dari Daun Teh (Theae Folium)
1. TUJUAN
Setelah melakukan rangkaian praktikum, mahasiswa dapat memahami dan melakukan :
• Ekstraksi padat-cair dari senyawa organik dari simplisia tanaman
• Ekstraksi cair-cair secara bertahap
• Kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dari senyawa organik
• Pemurnian hasil isolasi dengan sublimasi
2. DASAR TEORI
Sistematika tanaman teh (Theae sinensis) :
• Divisi : Spermatophyta ( Tumbuhan biji )
• Subdivisi : Angiospermae ( Tumbuhan Biji Terbuka )
• Kelas : Dicotyledoneae ( Tumbuhan biji belah )
• Subkelas : Dialypetalae
• Ordo : Guttiferales ( Clusiales )
• Familia : Camilliaceae ( Theaceae )
• Genus : Camellia
• Spesies : Camellia sinensis ; Theae sinensis
• Varietas : Assamica
Kandungan Theae Folium (daun teh)
Alkaloid golongan purin antara lain kofein, theofilin dan theobromin. Selain itu juga mengandung polifenol, tannin, asam fenolat, katekin (epikatekin/EC, Epigalat/EG, Epigalokatekin /EGC, Epigalo katekin Galat/EGCG, Quersetin (Soya, Noni.2007) ). Teh berguna untuk antioksidan (katekin), antikanker, mencegah peningkatan kolesterol dalam darah, anti diare (tanin).
Dalam daun teh kofein berada dalam prosentase 2–5 %. Kofein (1, 3, 7 Trimethilxantin) berupa kristal jarum mengkilat warna putih, tidak berbau dan berasa pahit. Kelarutan kofein dalam air (1 : 45,5 suhu 25º C; 1: 5,5 suhu 80º C; 1 : 1,5 suhu 100º C ), dalam alkohol (1 : 22); diklormetan (1:7); CHCL3 (1:6). Berat molekul 194,19 dan titik lebur 235.
Gambar struktur molekul kofein.
Kofein bersifat termostabil sehingga ekstraksi dapat dilakukan dengan cara refluks atau digesti. Penambahan MgO dapat memisahkan kofein dari senyawa – senyawa yang tidak diinginkan misalnya tanin. Jika konsentrasi basa terlalu tinggi dapat merusak kofein menjadi koefeedin. Penambahan asam sulfat untuk mengendapkan MgO yang tidak tersaring dengan menbentuk garam.
Kofein dalam fase cair diekstraksi dengan kloroform karena dalam suasana asam kelarutan kofein dalam kloroform lebih besar dari kelarutan dalam air. Kofein yang terekstraksi dalam kloroform dicuci dengan NaOH untuk menghilangkan warna alaminya juga untuk menetralkan kelebihan H2SO4. Kofein pada manusia mempunyai efek stimulasi SSP, relaksasi otot bronkus dan diuretik.
Ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi ekstraksi, diantaranya (Kirk-Othmer, 1998):
a. Suhu
Kelarutan bahan yang diekstraksi dan difusivitas biasanya akan meningkat dengan meningkatnya suhu, sehingga diperoleh laju ekstraksi yang tinggi. Pada beberapa kasus, batas atas untuk suhu operasi ditentukan oleh beberapa faktor, salah satunya adalah perlunya menghindari reaksi samping yang tidak diinginkan.
b. Ukuran partikel
Semakin kecil ukuran partikel, semakin besar luas bidang kontak antara padatan dan solven, serta semakin pendek jalur difusinya, yang menjadikan laju transfer massa semakin tinggi.
c. Faktor solven
Kafein biasanya diisolasi dengan ekstraksi menggunakan solven organik, dan kondisi ekstraksi (solven, suhu, waktu, pH, dan rasio komposisi solven dengan bahan) dapat mempengaruhi efisiensi ekstraksi kafein (Perva U et al., 2006)
3. METODE
1. Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan pekat atau kering yang diperoleh dengan mengekstraksi zat-zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian rupa sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.Ekstraksi adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan menggunakan pelarut cair. Ekstraksi merupakan proses penyarian simplisia nabati atau simplisia hewani dengan cara dan pelarut yang sesuai, bebas dari pengaruh cahaya langsung. Ekstraksi dapat dilakukan berbagai cara :
a. Ekstraksi padat – cair ( Leaching ) adalah :
transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang bersifat fisik karena komponen trlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dilakukan jika bahan yang dimaksud larutnya dalam solvent pengekstrak.
b. Ekstraksi cair – cair adalah :
Suatu proses transfer massa zat terlarut ( solut ) diantara 2 pelarut yang tidak saling campur. Zat yang diekstraksi terdapat di dalam campuran berbentuk cair. Tujuan utama ekstraksi pelarut adalah purifikasi. Purifikasi dapat terjadi jika solut memiliki koefisien partisi besar sedangkan pengotor memiliki koefisien partisi yang lebih rendah. Kegunaan lainnya untuk pemisahan dua senyawa atau lebih berdasarkan koefisien distribusinya, hal ini terjadi jika dua senyawa memiliki sifat kimia sangat berbeda.
2. Kromatografi
Dasar pemisahan: Perbedaan kecepatan migrasi komponennya / senyawa – senyawa yang dibawa oleh fase gerak dan ditahan secara selektif oleh fase diam, yang bertujuan untuk memisahkan senyawa – senyawa dengan waktu yang tidak terlalu lama. Metode kromatografi yang dipakai pada pratikum ini antara lain :
a. Kromatografi lapis tipis (KLT) :
Merupakan cara pemisahan zat yang cepat dengan menggunakan bahan berbutir – butir (fase diam) yang ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas/ kaca, logam, atau lapisan lain yang sesuai. Mekanisme pemisahan : adsorpsi dan partisi.
Penilaian kromatogram : angka Rf pada lempeng KLT.
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf ataun hRf.
atau
x 100
Jika angka hRf > hRf yang dinyatakan , dapat dikatakan kepolaran pelarut harus dikurangi, jika angka Rf < hRf yang dinyatakan, maka komponen polar pelarut harus dinaikkan ( Egon Stahl, 1985 ).
b. Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) :
KLTP masih merupakan metode yang banyak digunakan karena merupakan metode yang sederhana, relatif murah, cepat dan mampu memisahkan sampel antara 1mg – 1 g. KLTP digunakan pada pemurnian tahap akhir dalam prosedur isolasi (tergantung kompleksitas ekstrak), diutamakan untuk pemisahan campuran yang telah dipisahkan sebagian.
3. Sublimasi :
Sublimasi yaitu pemisahan komponen-komponen dalam campuran yang mudah menyublim dengan cara penyubliman melalui pemanasan. Sublimasi dapat dilakukan untuk memisahkan komponen campuran yang mudah menyublim. Dalam hal ini zat yang dapat menyublim adalah kofein.
4. ALAT DAN BAHAN
Metode Alat Bahan
ISOLASI Beker glas
Corong pisah
Corong gelas
Waterbath/pemanas
Klem
Statif
Serbuk teh kering
MgO
NaOH
Aquadest
CHCl3
KLT &KLTP Bak kromatografi (chamber)
Lempeng KLT silica gel GF254
Beker glas
Pipa kapiler
Kertas saring
Pelat kromatografi (alumina, kaca)
Oven
Kofein
Methanol
Eter
CHCl3
Silica gel GF254
SUBLIMASI Cawan penguap
Corong gelas
Kertas saring
Kapas
Neraca analitik
Asbes
Kaki tiga
Erlenmeyer
Sampel hasil KLT
6. DATA PERCOBAAN
- Berat sampel daun teh kering:
Berat daun teh kering + plastik 41,162 gram
Berat plastik 0,999 gram -
Berat sampel daun teh kering 40,163 gram
METODE ISOLASI / EKSTRAKSI
Berat zat yang di dapat metode isolasi/ ekstraksi:
Berat beker glass + zat 62,346 gram
Berat beker glass 62,090 gram -
Berat zat 0,144 gram
METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Dari hasil elusi KLT didapat:
x (jarak yang ditempuh solut) 4,4 cm
y (jarak yang ditempuh eluen sampai tanda batas) 5,0 cm
• Perhitungan Rf:
Rf =
=
= 88
Pembacaan pada sinar UV λ = 254 nm menunjukkan adanya senyawa kofein dengan adanya fluoresensi biru keunguan tetapi pada panjang gelombang 366 nm menunjukkan adanya senyawa pengotor karena ada bercak putih memanjang.
METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF
Dari hasil percobaan metode KLTP didapatkan :
Berat beker glass + zat 63,216 gram
Berat beker glass 63,047 gram-
Berat zat 0,169 gram
METODE SUBLIMASI
Cawan + zat belum murni 31,148 gram
Cawan (tara) 31,053 gram-
Berat zat belum murni 0,095 gram
Pemurnian zat:
Kertas timbang + zat 0,303 gram
Kertas timbang 0,258 gram-
Zat murni kofein 0,045 gram
Perhitungan Rendemen:
- R terhadap ekstrak kering
x 100%= x 100%
= 0,36%
- R terhadap kristal kofein thd ekstrak untuk KLTP
x 100%= x 100%
= 27%
7. PEMBAHASAN
a. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan proses penarikan, pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Praktikum ini, untuk tahap ekstraksi terjadi 2 macam yaitu: ekstraksi padat – cair dan ekstraksi cair – cair.
Ekstraksi padat – cair :
Dilakukan karena bahan yang dikehendaki dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi serbuk teh dengan aquadest ini termasuk proses digesti (maserasi dengan proses pengadukan kontinyu pada temperatur kamar ± 40 - 50º C). Adapun penambahan MgO (bersifat basa) untuk mengikat senyawa selain kofein dan H2SO4 10% pada saat pencampuran filtrat 1 dan 2 bermaksud untuk menurunkan pH (mengasamkan).
Ekstraksi cair – cair :
Pada ekstraksi cair – cair ini, percobaan dilakukan di corong pisah. Filtrat yang di dapat dari ekstraksi padat – cair + CHCL3 25 ml NaOH secukupnya + lalu gojog sampai 15 kali hingga jernih, diamkan sebentar tampung bagian bawahnya . Percobaan diulangi sebanyak 3 x agar hasilnya lebih optimal. Pada penambahan NaOH (secukupnya ) bermaksud : menarik sisa asam dan untuk pigmentasi.
b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Preparatif (KLTP)
Kromatografi Lapis Tipis
Menggunakan pelat alumina (alumina basa pH 10, karena bersifat basa) sebagai fase diam. Fase geraknya methanol : CHCL3 (1:1/ 5ml : 5ml) dijenuhkan dengan kertas saring di dalam chamber. Penotolan larutan ekstrak dan larutan blangko (kloroform) dengan pipa kapiler arah tegak lurus, setelah ditotolkan dikering anginkan. Selanjutnya dideteksi pada sinar UV λ 254 nm, penandaan dilakukan jika terjadi peredaman (kafein + pelarut merupakan larutan yang tak berwarna, tidak bisa dilihat secara kasat mata, dengan deteksi sinar UV dapat terlihat dengan terdapat noda yang menunjukkan pemisahan antara fase diam dan fase geraknya/ terjadi interaksi sinar dengan indikator). Pada λ 366 nm menunjukkan adanya senyawa pengotor karena terdapat bercak putih memanjang, disini fraksi blangko sebagai awalan/ base line. Dengan ini, KLT mempunyai keuntungan yaitu:
Waktu pemisahan yang cepat dan serbaguna (dapat digunakan berbagai senyawa tanaman).
Mengetahui kemurnian suatu senyawa (suatu senyawa dielusi dengan eluen beberapa beda polaritas menghasilkan 1 bercak).
Mendeteksi senyawa yang terkandung.
Standarisasi sampel (dengan parameter Rf-nya)
Perhitungan Rf (tanpa satuan) untuk mengetahui :
• Seberapa jauh bercak terelusi (Rf idealnya tidak lebih dari 1 (± 0,2 – 0,8)
• Bagaimana sifat kelarutannya
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Pada KLTP penggunaan cuplikan sampel lebih banyak dari KLT, hasilnya dapat digunakan analisa lanjutan, lempeng kaca yang digunakan adalah ukuran ±20cm×20cm. Silika gel GF 254 sebagai fase diam, fase gerak yang digunakan CHCL3 : methanol (1:1) yang dijenuhkan. Penotolan larutan ekstrak secara tegak lurus bentuk pita sampai habis dan cukup dikering-aginkan. Pengamatan/ identifikasi kofein pada UV λ 254 nm, penandaan dilakukan jika terjadi peredaman warna biru violet/ keunguan karena secara teori pada struktur molekul kofein terdapat gugus kromofor/ ikatan terkonjugasi yang menyerap energi sehingga mengalami eksitasi, dimana setelah molekul mengalami eksitasi ke tingkat energi lebih tinggi maka akan kembali ke keadaan semula (ground state) dan memancarkan energi yang terdeteksi oleh instrumen. Lalu dikerok dan masukkan ke Erlenmeyer dan untuk selanjutnya dilakukan tahap sublimasi.
c. Sublimasi
Pada tahap akhir proses ini adalah pemurnian kofein dari daun teh dilakukan dengan cara sublimasi. Tetapi tidak semua senyawa dapat dimurnikan dengan metode sublimasi. Senyawa lain dalam daun teh seperti tannin, katekin, dan golongan polifenol tidak bisa disublimasi, hanya kofein yang dapat dimurnikan dengan cara sublimasi. Pada dasarnya kofein (bersifat non-polar) yang akan disublimasi dilarutkan dalam kloroform (semipolar) sesuai prinsip like-dissolve-like (yang dilarutkan = yang terlarut). Hasil pemurnian yang diperoleh berupa hablur kristal jarum yang mengkilap berwarna putih tidak berbau, berasa pahit dan agak sukar larut dalam air.
8. KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan didapat kesimpulan bahwa:
• Daun Theae sinensis kering seberat 40,163 gram dilakukan isolasi kofein dengan metode:
- Ekstraksi, diperoleh hasil = 0,144 gram
- Kromatografi lapis tipis, diperoleh hasil Rf = 88 (0.88)
Pembacaan pada sinar UV λ = 254 nm menunjukkan adanya senyawa kofein dengan adanya fluoresensi biru keunguan tetapi pada λ 366 nm menunjukkan adanya senyawa pengotor karena ada bercak putih memanjang.
- Kromatografi lapis tipis preparatif, diperoleh hasil = 0,169 gram.
- Sublimasi didapat hasil:
Kristal kofein 0,045 gram berbentuk hablur kristal jarum, berwarna putih.
Dengan perolehan Rendemen:
1. R terhadap ekstrak kering = 0,36%.
2. R kristal terhadap ekstrak untuk preparatif = 27%.
9. DAFTAR PUSTAKA
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1980. “Materia Medika Indonesia”. Jilid IV.
Kirk-Othmer. 1998. Encyclopedia of Chemical Technology 4th Ed. 10:88
Tidak ada komentar:
Posting Komentar